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Cómo medir la viabilidad celular

By Jamie

Cómo medir la viabilidad celular


En la mayoría de los experimentos biológicos que implican el cultivo de células, un paso crítico incluye saber que las células están vivas y que están muertos en su muestra. Exclusión del colorante es el método más popular de medir la viabilidad celular. Exclusión de colorante se basa en la teoría de que las células vivas contienen membranas intactas y células muertas no, las células muertas por lo tanto absorben el colorante en el citoplasma. Hay diferentes tintes y los protocolos y los métodos que usted elija debe basarse en el precio, la sensibilidad, la facilidad y la duración del procedimiento. El azul tripán es un colorante común usado para medir la viabilidad celular debido a que el procedimiento se puede realizar en cinco a 10 minutos y cuesta sólo la cantidad del reactivo de colorante.

Instrucciones

1 Obtener un pellet de las células que estés de medición.

2 resuspender el botón celular en PBS para obtener aproximadamente 5 x 105 células / ml. PBS se utiliza porque las mediciones de viabilidad son más precisos cuando las células están en un ambiente libre de suero; proteínas de suero también pueden manchar y le dará resultados engañosos.

Añadir 3 partes iguales de suspensión celular en PBS a partes iguales de 0,4% azul de tripano colorante para obtener una dilución de 1 a 2 (ejemplo: 100 ul de células a 100 ul de azul de tripano) y mezclar pipeteando arriba y abajo.

4 Incubar la mezcla durante menos de tres minutos a temperatura ambiente. Si las células se cuentan después de aproximadamente cinco minutos, la viabilidad será inexacta debido a la muerte celular.

5 Con la hoja de la cubierta ya en el lugar, llenar cada lado de un mostrador hemocitómetro con la suspensión de células. Por lo general, cada parte tendrá 10 a 20 ul.

6 Coloque el hemocitómetro en el escenario de un microscopio de luz y se centran en las células.

7 Cada lado de la hemacitómetro contiene múltiples plazas. Cuente el número total de células en una plaza de la hemocitómetro. Luego, cuente el número de células viables (borrar) no viables (azul) y por separado, en la misma plaza.

8 Calcular el porcentaje de células viables en el cuadrado dividiendo el número de células viables por el número de células totales y multiplicando por 100. Hacer esto para múltiples plazas en el hemocitómetro para obtener una medición promedio viabilidad.

Consejos y advertencias

  • Contando las células muertas puede ser subjetiva, dependiendo de lo que el técnico considera una célula azul (la intensidad del color azul pueden variar dependiendo de cuánto fue absorbido en el citoplasma). Por lo tanto, es aconsejable hacer una medición de la viabilidad con al menos dos muestras separadas y obtener un promedio. Como alternativa, el técnico podría obtener de otra persona para llevar a cabo también el conde y comparar los resultados.
  • Use el equipo de protección personal cuando se realiza este ensayo, como guantes y una bata de laboratorio. De acuerdo con la Hoja de Datos de Seguridad de Materiales (MSDS), azul de tripano puede causar cáncer, por lo que la práctica de los métodos de seguridad de laboratorio apropiadas.